关键词
乳制品、氯霉素、固相萃取、磁性固相萃取、液相色谱质谱、LC-MS、SPE、mSPE
前言
氯霉素诞生于上世纪中期。是第一种通过化学合成方法大量生产的抗生素。由于其广谱性，且成本低廉易于生产而被广泛应用，特别是医疗体系较为落后的第三世界国家。不幸的是，氯霉素也被发现有明显的不良反应，主要表现为对骨髓造血机能的抑制而引起的贫血和白血病等。因此，目前临床上对其使用有着严格的限制。与此同时，由于其通过食物链累积和传递的影响，也在畜牧和水产饲养中被禁用。
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氯霉素（CAS. 56-75-7） |
目前，动物源性食品中氯霉素的提取和净化过程较为复杂。例如《食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 29688-2013）中规定，牛奶中氯霉素残留应以乙酸乙酯提取，并经正己烷脱脂和C18柱SPE净化。其过程繁琐且有毒有害试剂用量较大。
本文所述方法，仅通过简单的蛋白质沉淀和磁性固相萃取净化，且无需氮吹浓缩即可实现检测。磁性固相萃取（mSPE）是将传统固相萃取材料磁化，形成磁性分散萃取剂，结合全自动提取设备，无需全程人工操作，实现了一键运行、无人值守。相对于经典的固相萃取（SPE），该方法自动化程度高、简单高效、成本低廉，适合广泛推广。
AUTO M32是第一代自动化磁性萃取系统，结构简单、运行高效，结合方法学优化，最大上样体积可达3mL。适用于临床小分子疾病标志物、食品安全和法医毒物检测。
MagicFlux 1000是一种基于mSPE技术的全新全自动磁性固相萃取系统，可于30分钟内全自动处理最多二十个样品，每个样品的上样体积可达10mL。适用于食品安全、法医、环境污染物检测等多个领域中的样品净化。该系统使用10寸平板电脑，基于Windows10 操作系统和专用的软件，从移液、提取、输出样品完全自动化操作。
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AUTO M32 全自动提取系统 |
MagicFlux 1000 全自动磁性固相萃取系统 |
实验过程
标准曲线配置
以30%甲醇水配制浓度为0.4、1、2、5、10、20ng/mL氯霉素标准溶液，相当于原始样品中氯霉素残留量0.08、0.2、0.4、1、2、4μg/Kg。
样品处理
- 取以乙醇活化的4mg磁性HLB萃取剂，置于萃取管内。
- 称取2.0g牛奶，置于15mLPP试管中，先后加入1mL10%亚铁氰化钾溶液、1mL20%乙酸锌溶液、0.4mL甲醇，漩涡混匀，以8000rpm离心5min。
- 磁性固相萃取：方法一，移取1000μL上清液为上样溶液，放置于专用96孔板的第2~4列或第8~10列孔内，如下图移取适当溶剂置于其余孔位内，并设置AUTO M32全自动提取仪，进行mSPE操作。
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孔位 |
名称 |
加入液体 |
体积μL |
振荡搅拌时间s |
静置吸磁时间s |
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1（7） |
活化 |
水 |
600 |
60 |
30 |
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2（8） |
上样 |
上样溶液 |
1000 |
60 |
30 |
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3（9） |
上样 |
上样溶液 |
1000 |
60 |
30 |
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4（10） |
上样 |
上样溶液 |
1000 |
60 |
30 |
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5（11） |
淋洗 |
水 |
600 |
60 |
30 |
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6（12） |
洗脱 |
60%乙腈 |
200 |
80 |
30 |
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1 |
排废 |
/ |
600 |
10 |
0 |
方法二，将上一步完成离心后的15mLPP试管直接放入MagicFlux 1000全自动磁性固相萃取系统的上样位。参考上表在各溶剂位放入对应的溶剂，并设定运行程序。执行mSPE操作。
- 取上述洗脱液注入LC-MS/MS分析。
注：测试样品，准确称取2.00g牛奶，加入2.0μL的200ng/mL氯霉素标准溶液，相当于0.2μg/Kg，加入20 mL D5-CAP（200ng/mL）同位素标记标准溶液。如上所述进行提取和分析。
实验数据
如下图所示，本方法定量下限为0.4ng/mL（相当于牛奶中0.08μg/Kg）。可以看到各MRM通道的氯霉素色谱峰信号稳定清晰。
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0.4ng/mL（相当于牛奶中0.08μg/Kg）MRM色谱图 |
下图为测试样品（0.2μg/Kg）色谱图。该样品的氯霉素含量相当于《食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 29688-2013）所规定的定量下限。可以认为LC-MS结合磁性固相萃取法的整体灵敏度比上述标准方法提高了约2.5倍。
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牛奶中添加0.2μg/Kg样品MRM色谱图 |
如下表所示，牛奶中添加0.2μg/Kg样品，准确度（添加回收率）为90.9~116%，相对标准偏差为10.1%。
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名称 |
峰高 |
峰面积 |
计算浓度（μg/Kg） |
准确度（%） |
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测试样品1 |
1710 |
4890 |
0.231 |
116 |
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测试样品2 |
1740 |
4630 |
0.22 |
110 |
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测试样品3 |
1390 |
3780 |
0.182 |
90.9 |
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测试样品4 |
1480 |
4320 |
0.206 |
103 |
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平均值 |
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0.21（RSD10.1%） |
105 |
如下表，标准曲线各点的准确度为97.6~104.5，精密度为0.8~7.3%。
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序号 |
浓度ng/mL |
平均峰面积 |
RSD%（n=2） |
准确度% |
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1 |
0.08 |
1540 |
7.3 |
104.5 |
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2 |
0.2 |
4090 |
5.5 |
97.7 |
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3 |
0.4 |
8710 |
3.7 |
99.6 |
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4 |
1 |
22100 |
5.8 |
98.9 |
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5 |
2 |
44000 |
5.1 |
97.6 |
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6 |
4 |
92000 |
0.8 |
101.5 |
下图为定量MRM通道的氯霉素色谱峰标准曲线。
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氯霉素标准曲线 |
结果与讨论
综上数据可以看出，使用HLB磁性萃取剂，结合AUTO M32全自动萃取仪或MagicFlux 1000全自动磁性固相萃取仪，提取和净化牛奶中的氯霉素。经LC-MS/MS分析测试，线性良好，结果准确精密，符合基本定量测试的方法学要求。同时，磁性固相萃取技术（mSPE）结合全自动提取系统AUTO M32或MagicFlux 1000，大幅度减少传统SPE的移液操作和人为实时监测，节约了人力成本，并显著降低人为因素在前处理中的影响。
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